Методы искусственного оплодотворения для лечения бесплодия

О причинах возникновения заболеваний репродуктивной сферы и о методах искусственного оплодотворения, применяемых для лечения бесплодия у женщин и мужчин, рассказывает Шаова Адиюх, репродуктолог клиники «Центр ЭКО» Нальчик.

«Бесплодие в семейной паре может быть следствием различных нарушений деятельности организма у каждого из партнеров. Причинами бесплодия у женщин могут быть — овуляторные нарушения, отсутствие матки, непроходимость или отсутствие маточных труб, эндометриоз, гормональные нарушения, возрастные изменения. С этими проблемами можно справиться, используя стандартный метод экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Бесплодие у мужчин может быть связано с плохим качеством спермы, а также — как и у женщин — с эндокринными нарушениями. С этими проблемами можно справиться, используя инъекцию сперматозоида в цитоплазму ооцита (ИКСИ).

При ЭКО ооцит оплодотворяется тысячами сперматозоидов, полученными из эякулята. Основным принципом ЭКО является расположение подвижных сперматозоидов в непосредственной близости от яйцеклетки для того, чтобы произошло оплодотворение. Следовательно, при этом имитируется естественный процесс оплодотворения, так как сперматозоид должен самостоятельно проникнуть в ооцит, и отбор наилучшего сперматозоида происходит естественным путем.

С другой стороны, ИКСИ используется при плохом качестве спермы в эякуляте — при тяжелой олигозооспермии (низкой концентрации) и/или тяжелой астенозооспермии (низкой подвижности) и/или тяжелой тератозооспермии (плохой морфологии).

В ходе ЭКО сперматозоидом преодолеваются три естественных барьера. Первый барьер — это комплекс клеток кумулюса и лучистого венца, окружающих ооцит. Этот комплекс содержит полимеризованную гиалуроновую кислоту, которая расщепляется под действием фермента гиалуронидазы, выделяемого погибающими или погибшими сперматозоидами.

После того как сперматозоид проходит через комплекс клеток кумулюса и лучистого венца, он встречается со вторым барьером: прозрачной оболочкой (zona pellucida, ZP) ооцита. Эта оболочка имеет толщину 8–15 мкм и содержит гликопротеины (главным образом ZP-3). Только сперматозоид с нормальной морфологией и интактной акросомой способен прикрепиться к гликопротеину ZP-3.

Акросома сперматозоида содержит протеолитический фермент для расщепления прозрачной оболочки. После прикрепления сперматозоида к прозрачной оболочке происходит акросомная реакция с высвобождением содержимого акросомы. Эта реакция, по всей вероятности, продолжается всего 10–15 минут Ферменты расщепляют прозрачную оболочку, и сперматозоид может теперь попасть в перивителлиновое пространство.

В перивителлиновом пространстве сперматозоид должен преодолеть третий барьер: цитоплазматическую мембрану ооцита — оолемму. Слияние сперматозоида и ооцита приводит к высвобождению внутриклеточного кальция в ооците (индуцируется сперматозоидным фактором активации фосфолипазы C-zeta) и, как следствие, к выталкиванию кортикальных гранул в перивителлиновое пространство (кортикальная реакция). Гранулы содержат протеиназы, которые меняют структуру гликопротеинов ZP-3 и ZP-2, в результате чего прозрачная оболочка становится непроницаемой для других сперматозоидов (зонная реакция).

Таким образом, полностью предотвращается риск оплодотворения более чем одним сперматозоидом (полиспермии). После кортикальной реакции структура цитоскелета ооцита меняется, и сперматозоид поглощается ооцитом путем фагоцитоза.

Для выполнения ЭКО сперму необходимо обработать. При обработке удаляется семенная жидкость, чтобы произошла капацитация спермы. Капацитация повышает проницаемость цитоплазматической мембраны и активность сперматозоидов, а также подготавливает их к акросомной реакции. Кроме того, производится отбор подвижных сперматозоидов по градиенту плотности (90–45 %). Удаляются посторонние клетки — лейкоциты, незрелые сперматозоиды, эпителиальные клетки, а также фрагменты клеток.

При ЭКО ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК), полученные после пункции фолликулов, культивируются в микрокаплях культуральной среды для оплодотворения in vitro, содержащей глюкозу, присутствие которой необходимо для оплодотворения. Сперматозоиды добавляют к каждому ооциту, и гаметы культивируются вместе до утра.

Через шестнадцать часов после оплодотворения выполняется денудация ооцитов путем повторного переноса пипеткой. Ооциты несколько раз промываются, чтобы удалить клетки кумулюса и лучистого венца, а также сперматозоиды. После этого выполняется дальнейшее культивирование в культуральной среде для дробления, содержащей пируват и не содержащей глюкозу. В это время можно оценить зрелость ооцитов и проверить, произошло ли оплодотворение.

На практике ОКК после получения культивируются в покрытых маслом каплях культуральной среды для оплодотворения in vitro объемом 25 мкл. Проверка идентификации гамет и объема взвеси сперматозоидов, подлежащей добавлению к каждому ооциту (1–5 микролитов, которые содержат 5000–20 000 подвижных сперматозоидов с поступательным движением), выполняется эмбриологом.

Сперматозоиды добавляются к ОКК после «дозревания ооцитов», чтобы не пропустить время, когда становятся видимыми пронуклеусы — примерно через 16-20 часов после добавления сперматозоидов. Процедура выполняется в ламинарном потоке воздуха с визуализацией под стереомикроскопом с 10–40-х кратным увеличением.

При ИКСИ на каждый зрелый ооцит требуется всего лишь один сперматозоид.

ИКСИ рекомендуется в следующих ситуациях:

1) Неудачные попытки оплодотворения в двух или более циклах ЭКО;
2) Плохое качество спермы вследствие тяжелой олигозооспермии и/или тяжелой астенозооспермии и/или тяжелой тератозооспермии.

Сперматозоиды можно свободно выделить из эякулята, полученного путем мастурбации, а при нарушениях эякуляции – путем вибростимуляции, при параплегии – при помощи электростимуляции.

Для ИКСИ можно использовать сперматозоиды не только из эякулята. Возможно получение сперматозоидов из яичка и из придатка яичка, с применением методик ТЕЗЕ/ТЕЗА/ПЕЗА.

При ИКСИ преодолеваются все три барьера, которые сперматозоид должен пройти в процессе естественного оплодотворения и обычного ЭКО: клетки кумулюса и лучистого венца удаляются, чтобы определить зрелость ооцитов до инъекции и чтобы можно было выполнить инъекцию сперматозоида.

Денудация ооцитов выполняется в два этапа: при помощи фермента гиалуронидазы на первом этапе и механически, путем переноса пипеткой, на втором этапе. Два других барьера, прозрачная оболочка и оолемма, преодолеваются путем прямой инъекции в ооцит.

Для оплодотворения путем ИКСИ сперматозоид должен быть жизнеспособным. Единственным прямым способом определения жизнеспособности является оценка подвижности. Принято относить активноподвижные сперматозоиды с поступательным движением к классу А, малоподвижные с поступательным движением — к классу В, малоподвижные с отсутствием поступательного движения — к классу С, и неподвижные сперматозоиды — к классу D.

Даже при неподвижности сперматозоидов возможны несколько вариантов лечения. Оплодотворение невозможно только при некрозооспермии, когда сперматозоиды нежизнеспособны.

Для оценки жизнеспособности сперматозоидов можно провести эозиновый тест на жизнеспособность. Однако тест является инвазивным, и эти сперматозоиды нельзя использовать для инъекции. Существует четыре процедуры отбора жизнеспособных неподвижных сперматозоидов:

1) Тест иммобилизации хвоста или метод механического контакта для отбора жизнеспособных сперматозоидов;
2) Обработка пентоксифиллином для активации сперматозоидов;
3) Набухание хвостов сперматозоидов в гипоосмотической среде, которая представляет собой культуральную среду, разбавленную водой в равных соотношениях;
4) Нагревание хвоста сперматозоида лазерным ударом (лазерный отбор неподвижных сперматозоидов).

Однако отбор сперматозоидов с лучшими морфологическими характеристиками под 1500-кратным увеличением — так называемая «инъекция морфологически отобранного сперматозоида в цитоплазму ооцита», или ИМСИ, может быть более эффективной.

ИМСИ - инъекция морфологически отобранного сперматозоида в цитоплазму ооцита. Если сперматозоид не в состоянии активировать ооцит, можно использовать иономицин, чтобы индуцировать выделение кальция (что в норме происходит при оплодотворении и индуцируется сперматозоидным фактором активации фосфолипазы С-zeta).

Данный метод может использоваться у пациентов с глобозооспермией (сперматозоиды с круглой головкой, без акросомы) и при повторных неудачных попытках оплодотворения путем ИКСИ.

Репродуктолог клиники «Центр ЭКО» Нальчик – Шаова Адиюх

Клиника «Центр ЭКО» Нальчик оказывает помощь по лечению бесплодия с применением всех методов вспомогательных репродуктивных технологий – ЭКО, ИКСИ (ИМСИ), программы суррогатного материнство и донорства генетического материала. Задать все интересующие вас вопросы и записаться на консультацию Вы можете, позвонив по телефону или заполнив форму записи на сайте клиники.